1. 大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)概述大豆作為全球最重要的油料作物和植物蛋白來源其遺傳改良一直備受關(guān)注。傳統(tǒng)育種方法周期長、效率低而遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠直接將外源基因?qū)氪蠖够蚪M實現(xiàn)目標(biāo)性狀的精準(zhǔn)改良。這項技術(shù)自20世紀(jì)80年代首次在大豆上取得成功以來已經(jīng)成為現(xiàn)代分子育種的核心手段。我在實驗室從事大豆轉(zhuǎn)化工作已有七年時間最深切的體會是這既是一門科學(xué)更是一門藝術(shù)。同樣的protocol實驗方案不同操作者做出來的轉(zhuǎn)化效率可能相差十倍以上。本文將系統(tǒng)梳理大豆遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵技術(shù)要點并分享那些實驗室前輩口口相傳卻很少見于文獻(xiàn)的實戰(zhàn)經(jīng)驗。2. 遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建2.1 受體材料選擇農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是大豆遺傳轉(zhuǎn)化最常用的方法而受體材料的選擇直接影響轉(zhuǎn)化效率。我們實驗室通過長期篩選發(fā)現(xiàn)栽培品種Williams 82是最理想的受體材料其胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)85%以上種子需選擇飽滿、無病害的成熟種子儲存時間不宜超過1年最佳消毒方案70%乙醇1min → 2%次氯酸鈉15min → 無菌水沖洗5次關(guān)鍵提示不同品種對消毒劑的耐受性差異很大建議先做梯度測試。我們曾因消毒過度導(dǎo)致整批實驗材料死亡損失慘重。2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)基的配方直接影響愈傷組織的質(zhì)量和轉(zhuǎn)化效率。經(jīng)過數(shù)百次對比實驗我們優(yōu)化出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方如下成分濃度(mg/L)作用說明MS鹽4.3g基礎(chǔ)營養(yǎng)蔗糖30g碳源2,4-D2.0生長調(diào)節(jié)劑6-BA0.5細(xì)胞分裂素谷氨酰胺500促進(jìn)胚性愈傷形成水解酪蛋白500提供氨基酸特別要注意的是pH值的控制滅菌前調(diào)至5.8滅菌后會自然降至5.6左右這個微酸環(huán)境最有利于農(nóng)桿菌的侵染。3. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化操作流程3.1 工程菌株準(zhǔn)備我們常規(guī)使用的農(nóng)桿菌菌株是EHA105其特點是攜帶pCAMBIA系列雙元載體具有鏈霉素和卡那霉素抗性毒性基因經(jīng)過改造侵染力強(qiáng)但不會導(dǎo)致過度生長活化步驟從-80℃保存的甘油菌中劃線接種到Y(jié)EP平板含相應(yīng)抗生素28℃暗培養(yǎng)48小時至單菌落形成挑取單菌落接種于5ml液體YEP培養(yǎng)基220rpm振蕩培養(yǎng)16小時經(jīng)驗之談菌液OD600值控制在0.6-0.8時侵染效率最高。我們通常用分光光度計檢測也可以通過觀察菌液渾濁度判斷——剛好能看清報紙上的小字時為最佳。3.2 外植體侵染具體操作流程將大豆種子去殼后消毒接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基7天后切取胚軸切段約0.5cm長將切段浸入稀釋5倍的農(nóng)桿菌菌液加入100μM AS中15分鐘用無菌濾紙吸干多余菌液共培養(yǎng)3天22℃黑暗這個階段最容易出現(xiàn)的問題是農(nóng)桿菌過度生長。我們的解決方案是共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入200mg/L的頭孢噻肟嚴(yán)格控制共培養(yǎng)時間不超過72小時共培養(yǎng)后立即轉(zhuǎn)入含500mg/L頭孢的篩選培養(yǎng)基4. 篩選與再生體系4.1 抗性篩選常用的篩選標(biāo)記基因及其使用濃度bar基因抗除草劑3mg/L PPThpt基因抗潮霉素15mg/L HygromycinnptII基因抗卡那霉素100mg/L Kanamycin我們實驗室的篩選策略是第一階段2周低濃度篩選上述濃度的1/2第二階段4周全濃度篩選每2周繼代一次及時淘汰褐化組織4.2 植株再生獲得抗性愈傷后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基預(yù)再生階段2周降低2,4-D至0.2mg/L添加0.5mg/L TDZ芽誘導(dǎo)階段4周完全去除2,4-DTDZ增至1.0mg/L生根階段轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基添加0.1mg/L NAA再生過程中常見問題及解決方法芽畸形降低TDZ濃度增加光照強(qiáng)度玻璃化現(xiàn)象提高瓊脂濃度至0.8%減少培養(yǎng)基水分不生根嘗試在生根培養(yǎng)基中加入活性炭0.3%5. 分子檢測與性狀分析5.1 PCR檢測我們建議采用三重PCR驗證體系載體特異性引物如35S啟動子目的基因特異性引物內(nèi)參基因如大豆actin基因這樣可以有效避免假陽性結(jié)果。最近我們就發(fā)現(xiàn)一株轉(zhuǎn)化植株只整合了篩選標(biāo)記基因而丟失了目的基因幸虧通過三重檢測及時發(fā)現(xiàn)。5.2 Southern雜交對于重要轉(zhuǎn)化事件還需要進(jìn)行Southern雜交分析使用兩種限制性內(nèi)切酶如EcoRI和HindIII探針應(yīng)覆蓋目的基因全長特別注意拷貝數(shù)的確定單拷貝植株最有利于后續(xù)育種應(yīng)用6. 技術(shù)難點與解決方案在大豆遺傳轉(zhuǎn)化實踐中我們總結(jié)出三大技術(shù)瓶頸及其突破方法基因型依賴性問題建立胚性愈傷誘導(dǎo)率預(yù)測模型開發(fā)通用型輔助轉(zhuǎn)化載體含生長調(diào)控基因采用體細(xì)胞胚發(fā)生途徑替代器官發(fā)生途徑轉(zhuǎn)化效率低下優(yōu)化真空滲透參數(shù)-0.085MPa3min添加酚類化合物如乙酰丁香酮促進(jìn)T-DNA轉(zhuǎn)移開發(fā)新型納米材料輔助轉(zhuǎn)化技術(shù)嵌合體問題延長篩選周期至12周以上采用熒光標(biāo)記輔助選擇建立單細(xì)胞克隆再生體系最近我們實驗室嘗試在共培養(yǎng)階段添加一氧化氮供體SNP使轉(zhuǎn)化效率從原來的5%提升至18%這個改進(jìn)已經(jīng)申請了專利。7. 應(yīng)用案例與前景展望在實際應(yīng)用中我們通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)成功培育出多個具有重要農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因大豆品系抗蟲品系導(dǎo)入cry1Ac基因?qū)γ掴徬x的抗性提高90%耐除草劑品系表達(dá)epsps基因可耐受4倍田間用量草甘膦高油酸品系通過RNA干擾降低FAD2基因表達(dá)油酸含量達(dá)85%未來的技術(shù)發(fā)展方向主要集中在CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的應(yīng)用無標(biāo)記轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化多基因疊加轉(zhuǎn)化技術(shù)組織特異性表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)在大豆轉(zhuǎn)化工作中最讓我感慨的是每個成功的轉(zhuǎn)化事件背后往往伴隨著數(shù)十次失敗的嘗試。記得有一次為了獲得一個理想轉(zhuǎn)化株系我們連續(xù)做了8個月實驗最終在第137個轉(zhuǎn)化事件中找到了符合要求的材料。這種堅持或許就是分子育種工作者最珍貴的品質(zhì)。